turbidymetria.doc

TURBIDYMETRIA 

Temat: Oznaczanie stężenia białka surowicy krwi metodą turbidymetryczną, stosunki molowe reagentów, trwałość kompleksów

Cel ćwiczenia - określenie stężenia białka metodą turbidymetryczną; wyznaczenie

                          stosunków molowych reagentów metodą Joba; określenie trwałości

                          kompleksu metodą Schaeppi-Treadwella;

              Podstawą oznaczeń nefelometrycznych i turbidymetrycznych jest fizyczna niejednorodność próbki przejawiająca się występowaniem opalescencji lub zmętnienia. Za pomocą tych metod oznacza się stężenie substancji tworzących roztwory koloidowe o średnicy cząsteczek rzędu 1-100 nm i zawiesin, których wymiary cząstek przekraczają 100 nm.

              Podstawą turbidymetrii jest pomiar natężenia zmętnienia  (turbidancji Tb).

Kompleksy nierozpuszczalne wykazują selektywną turbidancję w zakresie widzialnym. Właściwość ta umożliwia wyznaczanie ich składu przy wykorzystaniu m.in. metody zmian ciągłych.

              W metodzie zmian ciągłych Joba mierzy się turbidancję serii roztworów o zmiennych stężeniach molowych obu składników, lecz o jednakowym stężeniu sumarycznym i jednakowej objętości.

      Tb

                                                 L

Tb*

                                             M

M*                                                                        

                0,0       0,2         0,4      0,6        0,8      1,0 stężenie I roztworu

         1,0        0,8          0,6      0,4        0,2      0,0     stężenie II roztworu

              Wykorzystując krzywe Joba można obliczyć stałe trwałości kompleksów metodą Schaeppi-Treadwella.

v    Stałe te wyznacza się z jednego punktu krzywej.

v    Punkt L wyznaczono przez ekstrapolację obu dolnych odcinków krzywej do punktu przecięcia.

v    Odpowiada on wyznaczonej graficznie turbidancji Tb*, podczas gdy M* odpowiada maksymalnej turbidancji kompleksu wyznaczonej eksperymentalnie.

v    Stałe trwałości wyznacza się ze wzorów:

                               c x  a2                           Tb* - M*

                      K =                              a =

                                 1 - a                                Tb*

gdzie: c – teoretyczne stężenie kompleksu odpowiadające punktowi M

          Tb* - turbidancja wyznaczona graficznie

          M* – turbidancja wyznaczona eksperymentalnie

              Im stała trwałości posiada mniejszą wartość liczbową, tym kompleks jest mniej trwały.

Ćwiczenie 1. Oznaczanie białka surowicy krwi metodą

                      turbidymetryczną

              Białka wytrąca się z roztworu mieszaniną kwasu sulfosalicylowego i siarczanu (VI) sodu.  Związki towarzyszące białkom nie mają wpływu na wynik pomiaru.

Aparatura

Spektrofotometr VIS SP-830 PLUS

Odczynniki

Ø     Odczynnik strącający (5% kwas sulfosalicylowy w 7% bezwodnym siarczanie (VI) sodu)

Ø     0,15 mol/l roztwór NaCl

Ø     Podstawowy roztwór albuminy – 5 mg/ml w 0,15 mol/l roztworze NaCl

Oznaczanie stężenia albuminy w oparciu o wykres kalibracyjny i współczynnik kalibracji

Ø     Sporządzić roztwory wzorcowe albuminy:

§        Do 6 ponumerowanych probówek odmierzyć: 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 i 1 ml roztworu podstawowego i uzupełnić do 1 ml 0,15 mol/l roztworem NaCl. Otrzymuje się roztwory wzorcowe albuminy o stężeniu 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0  i 5,0 mg/ml.

§        Do nowych 6 probówek) odpipetować po 0,5 ml wzorcowych roztworów albuminy, do 7 probówki 0,5 ml roztworu badanego (zadanie), do 8 probówki 0,5 ml roztworu surowicy krwi

§        Do 9 probówki odmierzyć 0,5 ml 0,15 mol/l roztworu NaCl (próba kontrolna)

§        Do wszystkich (9 probówek) dodać po 3,5 ml odczynnika strącającego. Próby dokładnie wymieszać.

§        Po 5 minutach odczytać absorbancję/turbidancję przy długości fali 450 nm wobec próby kontrolnej, za każdym razem mieszając próbę.

Ø     Wyniki zestawić w tabeli [stężenie – turbidancja] i sporządzić wykres zależności turbidancji od stężenia.                                                        

Ø     Zamieścić legendę wykresu kalibracyjnego.

Ø     Obliczyć współczynnik kalibracji dla poszczególnych roztworów albuminy korzystając ze wzoru:

F = c/Tb

Ø     Obliczyć średnią wartość współczynnika kalibracji.

Ø     Z wykresu kalibracyjnego odczytać stężenie próby badanej (zadanie) i stężenie roztworu białka surowicy krwi

Ø     Obliczyć również stężenie albuminy w próbie badanej i białka w surowicy krwi korzystając ze współczynnika kalibracji.

c = Tb x F

Ø     Obliczyć błąd bezwzględny i błąd względny pomiaru próby badanej

Błąd bezwzględny (Dx) - bezwzględna wartość różnicy między wartością rzeczywistą  (x) a wartością otrzymanego wyniku (xi).

                                     Dx = ½x – xi ½

Błąd względny (Dx wzgl.), wyraża stosunek wielkości błędu bezwzględnego (Dx) do mierzonej wartości prawdziwej (x).

                         Dx

       Dx wzgl =                 x 100%    

                          x

Błąd względny jest wartością niemianowaną. Wyrażony w procentach ułatwia porównanie wielkości błędów pomiędzy sobą.

Ćwiczenie 2. Wyznaczenie stosunków molowych

                     reagentów metodą  zmian ciągłych Joba

Aparatura

Spektrofotometr VIS SP-830 PLUS

Odczynniki

· 0,1 mmol/l roztwór heparyny

· 0,1 mmol/l roztwór protaminy

· H20 destylowana

Przygotowanie roztworów:

·        heparyny