bkr2015-01-27

mikroskopia fluorestencyjna i polaryzacyjna

metoda immunofluorestencyjna + dapi: Badanie cytoszkieletu tubulinowego i chromosomów w komórkach stożka wzrostu kożenia czosnku cebuli

lokalizacja tłuszczów zapasowych w nasionach z wykorzystaniem chlorofilu i przy użyciu mikroskopu fluorestencyjnego

mikroskop polaryzacyjny:zasada działania i jego zastosowanie w lokalizacji i badaniu właściwości celulozy, skrobi i kryształów

protoków immunolokalizacji mikrobubul

usuwanie żywicy ze skrawków – kąpiel w acetonie

uwodnienie skrawsków w buforze fosforanowym (PBS)

blokowanie grup aldehydowych za pomocą NH4Cl

płukanie w PBS

blokowanie niespecyficznych wiązań za pomocą surowicy wołu BSA

pierwszorzędowe przeciwciało monoklonalne mycie: anty-alfa tubulina

płukanie w PBS

drugorzędowe przeciwciała poliklonalne anty IgG sprzeżone z fluorochromem alexa fluor tm 488

płukanie w PBS 3×15 min (na ćw 1×10min)

barwienie DNA za pomocą fluorochromu DAPI 0,05µg/ml w PBS – 10min

płukanie w PBS 2×5min

wygaszenie w PBS

płukanie w PBS 2×5min

zamknięcie w środku zapobiegającym blaknięciu fluorochromu

obserwacja wyników w mikroskopie fluorestencyjnym z zastosowaniem odpowiednich filtrów

fluorestencja

fluorochromy – substancje wykorzystujące zjawisko fluorestencji

w biologi

chrolofilm – autofluorestencja czerwona

lignina – autofluorestencja jasnożółta

fikoerytryna autoffluorestencja pomarańczowożółta

fikocyjanina autofluorestencja czerwona

GFP na zielono

wtórna

oranż akrydyny DNA na żółtozielono, RNA na czerwono -pomarańczowo

DAPI DNA zekwencje bogate w A-T na niebiesko

Hoechst 33342 DNA na niebiesko

SYTO RNA na zielono

błękin aniliny kaloza na jasnożółto

system detekcji fluorestecencji

światło wzbudzające

fluorochrom

system filtrów

detektro (np. błona fotograficzna lub kamera CCD

instrumenty wykorzystujące zjawisko fluorestencji

spektrofluorometry i czytniki mikropłytek

mikroskopy fluorestencyjne

skany fluorestencyjne w tym czyniki mikromacierzy

cytometry przepływowe

fluorochromy blakną pod wwpływem światła

mikroskop fluorestencyjny epifluorestencja

od góry pobudzany jest fluorochrom

źródło światła

filtr wzbudzający

zwierciadło dichroniczne

obiektyw

obiekt

filtr zaporowy

okular – detektor

cytoszkielet tubulinoway (wrzeciono kariokinetyczne i cytokinetyczne) w komórkach stożka wzrostu korzenia

cytoszkielet

białka motoryczne np. kinezyna

cytokineza

podstawy teoretyczne immunolokalizcji

jednostopniowo dwu lub trzystopnowa

protokół immunokolokalizacji mikrotubul

materiał: stozki wzrostu korzenia cebuli Acepa

utrwalanie materiału 4% parafolmaldechyt +0,25% glutaraldechyd w fubforze stabilizującym mikrotubule

płukanie w buforze

odwodnienie w szerego alkoholowym

przsycenei życwią syntetyczną (metakrylan butylowometylowy BMM

polimeryzacja żywicy w ultafiolecie w temp -20°C

kontrole w precedurach immunolokalizacji

pozytywne

negatywen

              negatywne kontrola tkankowa

              negatywna kontrola przeciwciałami

                            brak i przeciwciała np. surowcia ze zwirzeęcia nieimunizowanego

                            brak ii przeciwciała

mikrotubule

Preparaty kontrolne (negatywna) brak przciwciała I rzędowo przy zastosowaniu filtra potrójnego brak sygnału zielonego, natomiast jądra i chromosomy Na niebiesko – pobudzenie układu …

Preparaty z pełnym protokołem przy pobudzeniu filtrem potrójnym

jędra i chromosomy na niebiesko (pobudzenie ultrafioletem

mikrotubule na zielono aleksafluor 448 pobudzenie niebieskim

a wszczególności pierścień fazowy wrzeciona kariokinetyczne jąderko i fragmoplast, mikrotubule korowe na zielono

barwienie tłuszczu

kontrola skrawki ze słonwcznika w wodzie

pobudzenie ultrafiloteltem

świecą na niebiesko

kontrola negatywna tkankowa skrawki z fasoli pobudzone utralfioletem świecą z niewielką ilością czerwonego

skrawki słonecznika i dyni traktowane  chrolofilem świecą głównie na czerwono w miejscu gdzie są ciała tłuszczowe

Barwienie tłuszczów ekstrakterm chrolofilu

nasiona roślin oleistych

etanolowy estrakt chlorofilu

inkubowanie przekroje poprzeczne nasion w czystym lub rozcięcoznym ekstrakcie chlorofilu 100% 50 % 20% 5 w szkiełku zegarkowym

płukać w h2o dest 2 razy po 0,5 min

zamknąć na szkiełku w kropli owdy

obserwować przy  350 nm uv

kontrole skrawki z nasienia fasoli

skrawki nie inkubowany chlorofilem

mikroskopia polaryzacyjna

do określania oriętacji fali elektromagnetycznej bierze się kierunek drgań fali elektromatgnetycznej

falę spolaryzowaną można uzyskać przez

selektywną emisję – źródlo fali wykonuje drgania w jedym kierunku

selektywne pochłanianie

pojedyczńe rozproszenie

odbicie od ośrodka przezroczystek

dwójłomność

odbicie od ośrodka przezroczystego

kąt brosfera

dwójłomność

Pryzmat Nicola

płytki opuźniające dwójłomne falówka półfalówka ćwerćflówka

wytworzenie róznicy drogi optycznej promieni zwyczajnego i nadzwyczajnego

przy skrzyżowanych prostopadle polaryzatorze i analizatorze uzyskujemy ciemne pole

świecą tylko struktury anizotropowe: ziarna skrobi i celulozowe ściany