bkr2015-01-27
mikroskopia fluorestencyjna i polaryzacyjna
metoda immunofluorestencyjna + dapi: Badanie cytoszkieletu tubulinowego i chromosomów w komórkach stożka wzrostu kożenia czosnku cebuli
lokalizacja tłuszczów zapasowych w nasionach z wykorzystaniem chlorofilu i przy użyciu mikroskopu fluorestencyjnego
mikroskop polaryzacyjny:zasada działania i jego zastosowanie w lokalizacji i badaniu właściwości celulozy, skrobi i kryształów
usuwanie żywicy ze skrawków – kąpiel w acetonie
uwodnienie skrawsków w buforze fosforanowym (PBS)
blokowanie grup aldehydowych za pomocą NH4Cl
płukanie w PBS
blokowanie niespecyficznych wiązań za pomocą surowicy wołu BSA
pierwszorzędowe przeciwciało monoklonalne mycie: anty-alfa tubulina
drugorzędowe przeciwciała poliklonalne anty IgG sprzeżone z fluorochromem alexa fluor tm 488
płukanie w PBS 3×15 min (na ćw 1×10min)
barwienie DNA za pomocą fluorochromu DAPI 0,05µg/ml w PBS – 10min
płukanie w PBS 2×5min
wygaszenie w PBS
zamknięcie w środku zapobiegającym blaknięciu fluorochromu
obserwacja wyników w mikroskopie fluorestencyjnym z zastosowaniem odpowiednich filtrów
fluorochromy – substancje wykorzystujące zjawisko fluorestencji
w biologi
chrolofilm – autofluorestencja czerwona
lignina – autofluorestencja jasnożółta
fikoerytryna autoffluorestencja pomarańczowożółta
fikocyjanina autofluorestencja czerwona
GFP na zielono
wtórna
oranż akrydyny DNA na żółtozielono, RNA na czerwono -pomarańczowo
DAPI DNA zekwencje bogate w A-T na niebiesko
Hoechst 33342 DNA na niebiesko
SYTO RNA na zielono
błękin aniliny kaloza na jasnożółto
system detekcji fluorestecencji
światło wzbudzające
fluorochrom
system filtrów
detektro (np. błona fotograficzna lub kamera CCD
instrumenty wykorzystujące zjawisko fluorestencji
spektrofluorometry i czytniki mikropłytek
mikroskopy fluorestencyjne
skany fluorestencyjne w tym czyniki mikromacierzy
cytometry przepływowe
fluorochromy blakną pod wwpływem światła
mikroskop fluorestencyjny epifluorestencja
od góry pobudzany jest fluorochrom
źródło światła
filtr wzbudzający
zwierciadło dichroniczne
obiektyw
obiekt
filtr zaporowy
okular – detektor
cytoszkielet tubulinoway (wrzeciono kariokinetyczne i cytokinetyczne) w komórkach stożka wzrostu korzenia
cytoszkielet
białka motoryczne np. kinezyna
cytokineza
podstawy teoretyczne immunolokalizcji
jednostopniowo dwu lub trzystopnowa
protokół immunokolokalizacji mikrotubul
materiał: stozki wzrostu korzenia cebuli Acepa
utrwalanie materiału 4% parafolmaldechyt +0,25% glutaraldechyd w fubforze stabilizującym mikrotubule
płukanie w buforze
odwodnienie w szerego alkoholowym
przsycenei życwią syntetyczną (metakrylan butylowometylowy BMM
polimeryzacja żywicy w ultafiolecie w temp -20°C
kontrole w precedurach immunolokalizacji
pozytywne
negatywen
negatywne kontrola tkankowa
negatywna kontrola przeciwciałami
brak i przeciwciała np. surowcia ze zwirzeęcia nieimunizowanego
brak ii przeciwciała
mikrotubule
Preparaty kontrolne (negatywna) brak przciwciała I rzędowo przy zastosowaniu filtra potrójnego brak sygnału zielonego, natomiast jądra i chromosomy Na niebiesko – pobudzenie układu …
Preparaty z pełnym protokołem przy pobudzeniu filtrem potrójnym
jędra i chromosomy na niebiesko (pobudzenie ultrafioletem
mikrotubule na zielono aleksafluor 448 pobudzenie niebieskim
a wszczególności pierścień fazowy wrzeciona kariokinetyczne jąderko i fragmoplast, mikrotubule korowe na zielono
barwienie tłuszczu
kontrola skrawki ze słonwcznika w wodzie
pobudzenie ultrafiloteltem
świecą na niebiesko
kontrola negatywna tkankowa skrawki z fasoli pobudzone utralfioletem świecą z niewielką ilością czerwonego
skrawki słonecznika i dyni traktowane chrolofilem świecą głównie na czerwono w miejscu gdzie są ciała tłuszczowe
Barwienie tłuszczów ekstrakterm chrolofilu
nasiona roślin oleistych
etanolowy estrakt chlorofilu
inkubowanie przekroje poprzeczne nasion w czystym lub rozcięcoznym ekstrakcie chlorofilu 100% 50 % 20% 5 w szkiełku zegarkowym
płukać w h2o dest 2 razy po 0,5 min
zamknąć na szkiełku w kropli owdy
obserwować przy 350 nm uv
kontrole skrawki z nasienia fasoli
skrawki nie inkubowany chlorofilem
mikroskopia polaryzacyjna
do określania oriętacji fali elektromagnetycznej bierze się kierunek drgań fali elektromatgnetycznej
falę spolaryzowaną można uzyskać przez
selektywną emisję – źródlo fali wykonuje drgania w jedym kierunku
selektywne pochłanianie
pojedyczńe rozproszenie
odbicie od ośrodka przezroczystek
dwójłomność
odbicie od ośrodka przezroczystego
kąt brosfera
Pryzmat Nicola
płytki opuźniające dwójłomne falówka półfalówka ćwerćflówka
wytworzenie róznicy drogi optycznej promieni zwyczajnego i nadzwyczajnego
przy skrzyżowanych prostopadle polaryzatorze i analizatorze uzyskujemy ciemne pole
świecą tylko struktury anizotropowe: ziarna skrobi i celulozowe ściany
wrib.biologia