pektyny.doc

Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności

Biotechnologia

Enzymatyczna hydroliza pektyn

Pektyny stanowią mieszaninę węglowodanów występujących w ścianach komórkowych wielu roślin. Pektyny są polisacharydami i oligosacharydami o zmiennym składzie. Przede wszystkim są to poliuronidy składające się z połączonych ze sobą wiązaniami α-1,4-glikozydowymi jednostek kwasu D-galakturonowego, które w znacznej części są zestryfikowane alkoholem metylowym. Pektyny dla ludzi, pod względem odżywczym są ciałami balastowymi. Pod względem żywieniowym stanowią jedną z frakcji rozpuszczalnego włókna pokarmowego (błonnika). Substancje pektynowe są związkami szeroko rozpowszechnionymi w przyrodzie. Występują głównie w przestrzeni międzykomórkowej oraz w ścianie komórek roślinnych. Wiele mikroorganizmów jest w stanie rozkładać pektynę.

Wyróżniamy dwa rodzaje pektyn, w zależności od stopnia estryfikacji:

·         wysokometoksylowane (WM), w których zestryfikowanych jest >50% grup karboksylowych reszt kwasu galakturonowego;

·         niskometoksylowane (NM), w których stopień estryfikacji jest mniejszy od 50%.

Wspólną cechą pektyn jest zdolność do tworzenia żeli w kwaśnych warunkach. Zdolność żelowania zależna jest od stopnia zmetoksylowania pektyn. Pektyny wysokometoksylowane żelują przy pH 3,0, stężeniu cukru 65% oraz zawartości pektyn 0,3 - 2%. Żele pektyn niskometoksylowanych powstają przy niższym stężeniu cukru (30-40%) oraz w szerszym zakresie pH (3-6). Jednak niezbędnym czynnikiem utworzenia trójwymiarowej siatki żelu jest obecność jonów wapnia, w stężeniu 0,01 - 0,1%. Zawartość pektyn wynosi wtedy 1,5 - 3,0%. Z tego względu są one wykorzystywane w przemyśle spożywczym jako środek zagęszczający. Pektyny między innymi odpowiedzialne są za zestalanie się dżemów i powideł.

Enzymy pektynolityczne – enzymy degradujące substancje pektynowe, wytwarzane przez rośliny i wiele drobnoustrojów. Należą do nich enzymy deestryfikujące i depolimeryzujące.

·         Pektynoesteraza

Pektynoesterazy (PE) hydrolizują wiązania estrowe w pektynie z uwolnieniem alkoholu metylowego.

Występują one u wielu roślin i drobnoustrojów, a szczególnie wysoką aktywność wykazują

pektynoesterazy owoców cytrusowych i pomidorów. Pektynoesterazy roślinne atakują cząsteczkę

pektyny od redukującego końca, albo też obok wolnej grupy karboksylowej i dalej działają wzdłuż

łańcucha.

·         Poligalakturonazy

Endopoligalakturonazy (endo-PG) hydrolizują wewnętrzne wiązania α-1,4-glikozydowe w kwasie

pektowym w sposob nieuporządkowany, wytwarzając oligopoligalakturonidy. Enzymy te

rozszczepiają jedynie wiązania glikozydowe sąsiadujące z wolną grupą karboksylową.

·         Egzopoligalakturonazy

Egzopoligalakturonaza 1 (egzo-PG-1) uwalnia od nieredukującego końca kwasu pektowego kolejne

reszty kwasu D-galakturonowego, druga Egzo-PG-2 odszczepia od nieredukującego końca

digalakturonidy.

·         Liaza pektynianowa

Rozszczepia na drodze transeliminacji wewnętrzne wiązania α-1,4-glikozydowe w pektynie, nie działa

natomiast na kwas pektowy.

·         Liaza pektatowa

Rozszczepia na drodze transeliminacji wewnętrzne wiązania α-1,4-glikozydowe w kwasie

poligalakturonowym, lecz nie działa na pektyny.

W przemysłowej produkcji enzymów pektynolitycznych wykorzystywane są głównie grzyby mikroskopowe, w szczególności z rodzaju Aspergillus.

Preparaty pektynolityczne znajdują zastosowanie w przemyśle spożywczym, przede wszystkim owocowo-warzywnym podczas produkcji różnych przetworów, oraz w przemyśle winiarskim. Preparaty te stosuje się do:

·         - klarowania win,

·         - otrzymywania soków klarownych,

·         - zwiększania wydajności soku i właściwej ekstrakcji substancji barwnych i zapachowych,

·         - rozpłynniania surowców przy produkcji pulp, puree, nektarów.

Enzymy pektynolityczne mogą być wykorzystywane poza przemysłem spożywczym, np. w procesie konserwacji drewna i w maceracji łodyg lnu.

Celem ćwiczenia jest poznanie metod oznaczania najważniejszych aktywności charakteryzujących preparaty pektynolityczne:

• ogólną aktywność pektynolityczną, wyrażaną w °PM, oznacza się na postawie spadku lepkości roztworu pektyny pod działaniem preparatu pektynolitycznego.

• aktywność pektynoesterazy (PE) oznacza się na podstawie ilości grup karboksylowych uwolnionych w wyniku enzymatycznej hydrolizy wiązania estrowego w pektynie,

• aktywność poligalakturonazy (PG) omacza się na podstawie ilości grup aldehydowych uwolnionych podczas enzymatycznej hydrolizy wiązania α-1,4-glikozydowego w kwasie poligalakturonowytn lub w niskozmetoksylowanej pektynie.

Wykonanie ćwiczenia

2.1. Oznaczanie ogólnej aktywności pektynolitycznej

Próba 0

Zmierzono czas wypływu przez kapilarę wiskozymetru wody destylowanej o temperaturze 20°C – H2O (sekundy)

Próba I

Do 30 ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8, o temperaturze 20°C, wprowadzono 0,3 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszano. Następnie odpowiednią ilość roztworu próby 1 (10 – 20 ml) wlano do wiskozymetru i zmierzono czas wypływu - ta - (sek).

Wyliczyć lepkość początkową roztworu pektyny (Va) z wzoru:

Próba 2

Do 30 ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8, o temperaturze 20°C, wprowadzono 0,3 ml odpowiednio rozcieńczonego tym buforem enzymu, dokładnie wymieszano i inkubowano w temperaturze 20°C w ciągu 30 minut. Po tym czasie wlano do wiskozymetru 10 – 20 ml roztworu próby 2 i zmierzyć czas wypływu - t (sek).

Obliczono lepkość roztworu pektyny (V) po określonym czasie działania enzymu ze wzoru:

Następnie obliczono procentowy spadek lepkości roztworu pektyny (A) (patrz obliczenia), który powinien być zawarty w przedziale 50 - 60%. Gdy jest niższy, należy wydłużyć czas reakcji enzymatycznej (pozostawiając mieszaninę w wiskozymetrze) i po kolejnych 20 min. (czyli po 50 min. reakcji) zmierzyć czas wypływu roztworu przez kapilarę wiskozymetru, wyliczyć V a następnie A

Próba 3 (nie wykonywana na ćwiczeniach)

Do 30 ml 0,5% roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 wprowadzić 2 ml enzymu, dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze 20°C w czasie 18 godzin. Po tym czasie wlać do wiskozymetru 10-20ml roztworu próby 3 i mierzyć czas  - t0 (sek).

Obliczono lepkość roztworu po całkowitej hydrolizie pektyny, czyli tzw. lepkość graniczna (V0) ze wzoru:

Graniczna lepkość V0 wynosi ok. 1,1.

OBLICZENIA

Ogólną aktywność pektynolityczną, wyrażoną w °PM wyliczono ze wzoru:

gdzie:

A- procentowy spadek lepkości pektyny, zadanej preparatem enzymatycznym obliczono ze wzoru:

              (w przedziale 50- 60%)

T - czas, w którym nastąpił właściwy spadek lepkości (sek)

Uwaga: Jeżeli reakcja trwała 30 min., T wynosi 1800 sek, jeśli 50 min. - 3000 sek, itd.

CE - stężenie preparatu enzymatycznego w roztworze pektyny (%)

Uwaga: Do 30 ml roztworu pektyny wprowadza się 0,3 ml odpowiednio rozcieńczonego preparatu enzymatycznego. Przeliczając na 100 ml roztworu pektyny, ilość wprowadzonego preparatu wynosiłaby 1 ml. Z definicji stężenia procentowego (w/v) wiadomo, że jest to ilość gramów (g) substancji zawartej w 100 ml roztworu. Należy więc wyliczyć ilość g wyjściowego preparatu enzymatycznego w 1 ml użytego do reakcji roztworu enzymu.

°PM - określają, w ilu litrach 0,5% roztworu pektyny nastąpi spadek lepkości o 85% w ciągu 5 godzin w temperaturze 20°C, pod działaniem  1 kg preparatu pektynolitycznego.

Wyniki przedstawiono w Tabeli 1.

Tabela 1. Ogólna aktywność pektynolityczna

Wnioski: Obliczając aktywność pektynolityczną stwierdzamy w ilu litrach 0,5% roztworu pektyny nastąpi spadek lepkości o 85% w ciągu 5 godzin w temperaturze 20o, pod działaniem 1 kg preparatu pektynolitycznego. Spadek lepkości jest wynikiem sumarycznego działania kompleksu enzymów pektynolitycznych zawartych w preparacie. Na podstawie danych w tabeli stwierdzamy różne wartości aktywności pektynolitycznej dla każdego z trzech badanych preparatów. Najbliższe sobie wyniki aktywności pektynolitycznej uzyskano dla preparatu Pektopol 2009. Dla pozostałych dwóch preparatów- Pektopol 2007 i Pektynaza wartości te znacznie się różnią. Może to być spowodowane niedokładnością wykonywania ćwiczenia przez poszczególne grupy.

Obliczenia dla Pektopol 2007

Próba 1

czas przepływu wody przez kapilarę wiskozymetru t H2O 0,52 s

czas przepływu roztworu ta=2, 15 min

Wyliczenie lepkości początkowej roztworu pektyny

Va=ta/tH2O= 135/53=2,547

Próba 2

t=90s

Wyliczenie lepkości roztworu pektyny po 30 minutach

V=t/ tH2O=90/53=1,69

Próba 3

V0=1,1- graniczna lepkość

Obliczanie spadku lepkości pektyny

A- procentowy spadek lepkości pektyny wyliczamy ze wzoru:

A=(Va...